التراسونیک و تولید واکسن کرونا

شکستن دیواره سلولی و استخراج محتوی سلولی توسط  اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  روشی قابل اطمینان برای شکستن دیواره سلولی و آزادسازی ویروس­ها، پروتئین­های ویروسی، DNA و RNA است.  سالهاست که از اولتراسونیک  (تابش فراصوت) در مطالعات سلولی استفاده می شود.

اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  در مطالعات ویروس کرونا

استخراج ویروس­ها از میان بافت اندام،(به عنوان مثال اسید نوکلئیک، کاپسومرها، گلیکوپروتئین­ها) گام مهمی در آماده­سازی نمونه پیش از آنالیز ویروس است. هموژینایزر اولتراسونیک  (تابش فراصوت درون محلول)  روشی سریع، آسان و تکرارپذیر برای آماده­سازی نمونه­ هایی همچون همگن ­سازی بافت، تخریب دیواره سلول، استخراج ماده درون سلولی و همچنین تفکیک DNA و RNA است. آماده­سازی نمونه به روش اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  گامی متداول پیش از واکنش زنجیره‌ای پلیمرها (PCR) است.

 کاربرد اولتراسونیک  (تابش فراصوت) در مواجه با ویروس کرونا (کووید 19، سارس-کو-2) اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  ابزاری بسیار قویست که در زیست­شناسی، شیمی سلولی مولکولی و بیوشیمی و همچنین تولید دارو به کار می­رود. علوم زیستی از همگن­ساز(هموژنایزر)های اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  برای تجزیه سلول و استخراج پروتئین و دیگر مواد درون سلولی بهره می­گیرند. صنعت داروسازی از اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  در سنتز مولکول­های فعال دارویی برای تولید واکسن و فرمولاسیون آن­ها به صورت حامل داروی نانویی استفاده می­کند. در جدال علیه ویروس نوظهور کرونا SARS-CoV-2 از اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  در تحقیقات، علوم زیستی و داروسازی استفاده می ­شود.

کاربرد اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  در تولید واکسن

اولتراسونیک(تابش فراصوت) روشی اثبات شده برای از بین بردن یا غیرفعال کردن ویروس­ها، باکتری­ها و مخمر­هاست. اولتراسونیک(تابش فراصوت)  برای تخریب سلول­ها، مثلاً سلول­های ویروسی یا باکتریال و آزادسازی ماده درون سلولی، مثلاً پروتئین­ها، DNA و RNA، آنزیم­ها و مواد فعال­ زیستی (bio-actives) مناسب است. در تولید واکسن، دیسپرس توسط اولتراسونیک و تراکم­زدایی را می­توان در مراحل مختلفی به کار برد تا به سوسپانسیونی همگن دست یافت. برای تولید واکسن به کمک اولتراسونیک (تابش فراصوت)، باید زیر  واحد پروتئینی غیرفعال، ضعیف شده باشند. در واکسن­های کانژوگه، بایستی سلول­ها غیرفعال، لیز یا کشته شده استفاده شوند. می­توان سلول­ها و میکروب­ها را با دوز و شدت مناسب سونیکیشن(تابش فراصوت) در راستای هدف فرآیند تغییر داد.

 در این موارد از امواج اولتراسونیک  (تابش فراصوت) می توان استفاده کرد:

• تجزیه و شکست سلول­ها
• غیرفعال سازی سلول­های ویروسی و باکتریایی
• آزادسازی ماده درون سلولی مثل پروتئین­ها و آنتی ­ژن­ها
• تحریک فعالیت باکتریایی
•  تهیه حامل­های نانویی دارو
• فعال یا غیرفعال­سازی آنزیم­ها
•  تهیه نانو-امولوسیون ها و دبل ­امولوسیون ها

تولید واکسن با کمک التراسونیک

اولتراسونیک(تابش فراصوت)  می­تواند در مراحل مختلف تولید واکسن مفید باشد. اولین مرحله درتولید یک واکسن، تولید خود آنتی­ژن است. با توجه به نوع پاتوژن، روش تولید آنتی­ژن تغییر می­کند: برخلاف این که ویروس­ها یا روی سلول­­های بنیادی مثل تخم مرغ (مثلاً آنفولانزا) یا روی خطوط سلولی پیوسته مثل سلول­های کشت­شده انسانی (مثلاً هپاتیت آ) رشد می­کنند، باکتری­ها روی راکتورهای زیستی رشد می­کنند (مثل هموفیلوس آنفولانزا نوع ب). پروتئین­های نوترکیب که از ویروس یا باکتری­ها گرفته می­شوند می­توانند در مخمر و باکتری یا محیط کشت سلولی نیز رشد داده شوند. هنگامی که آنتی­ژن تولید شد، بایستی از سلولی که در آن رشد کرده جدا شود.

ویروس باید بدون نیاز به تخلیص دوباره غیرفعال گردد. پروتئین­های نوترکیب به فرآیندهای متعددی شامل اولترافیلتراسیون و کروماتوگرافی ستونی نیاز دارد. با توجه به فرمول واکسن، ادجووانت، عامل­های پایدارکننده و نگه­دارنده­ها افزوده می­شوند. ادجووانت­ها پاسخ ایمنی آنتی­ژن، پایدارکننده را بهبود می­بخشند و نگه­دارنده­ها مدت نگه­داری در قفسه را افزایش می­دهند.

تابش فراصوت می­تواند در مراحل مختلفی در طول تولید واکسن به کار برده شود. در این روش، به عنوان یک روش پردازش غیرحرارتی، از تخریب گرمایی مواد با ارزش پرهیز می­شود. در زیر به متداول­ترین مواردی که فراصوت در آن­ها به تولید واکسن کمک می­کند می­پردازیم:

• پراکنش آنتی­ژن

آنتی­ژن­هایی مثل قطعه سلول یا آنتی­ژن پروتئین بایستی به صورت همگنی در قالب سوسپانسیون، پلیمر، یا کپسول لیپوزومی پراکنده شوند تا به فرمول پایداری از واکسن دست یابیم. سونیکاسیون روشی باقدمت برای تهیه پراکنش­های باکیفیت در تولید محصولات دارویی است و در نتیجه تکنیکی اثبات شده در صنعت مدرن تولید واکسن است.

ادجوانت­های با پایه آلومینیومی، تشکیل شده از ذرات اولیه بسیار ریز، از ادجوانت­های متداول هستند که به راحتی در فرمول واکسن ترکیب شده و به یک واحد عملکردی (functioning unit) تبدیل می­شوند. جهت ترکیب ادجوانت­ها با آنتی­ژن­ها، ترکیب همگنی از آنتی­ژن در آلومینیوم حاوی واکسن نیاز است. پراکنش اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  این ترکیبات همگن از آنتی­ژن و ادجوانت­ را مهیا می­کند. (مثل آلهیدروژل™[1] )

• استخراج محتوی سلولی

آنتی­ژن­هایی که از میکروارگانیسم­ها تولید می­شوند باید از سلول میکروبی جدا شوند. سونیکاسیون تکنولوژی اثبات شده­ای برای شکست  سلولی و استخراج است. با تنظیم پارامترهای سونیکاسیون می­توان سلول­ها را سوراخ یا تخریب کرد تا آنتی­ژن­های هدف به دست آیند و ایزوله شوند.

• غیرفعال سازی پاتوژن­ها

از آلتراسوند پر قدرت، برای تخریب و کشتن میکروارگانیسم­هایی مثل باکتری­ها و ویروس­ها استفاده می­شود. برای مثال ثابت شده است که غیرفعال سازی باکتری ای کولای[2] از طریق اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  و سپس پرتودهی موثرترین روش برای تولید واکسن کولیباسیلوز[3] است. (ملامد[4] و همکاران، 1991)

روش­های متداول برای غیرفعال سازی میکروبی پاستوریزاسیون گرمایی و استرلیزاسیون هستند که بر اساس قرارگیری در معرض دمای بالا کار می­کنند و عموماً باعث زوال ناشی از حرارت در خواص عملکردی می­شوند. ترکیبی از روش سونیکاسیون و گرما (ترمو سونیکاسیون) می­تواند نرخ استرلیزاسیون را بالا ببرد. چرا که شدت و مدت حرارت به میزان قابل توجهی پایین می­آید، بنابراین در ترکیباتی که به دما حساس هستند (مانند پروتئین­ها و آنتی­ژن­ها) کاربرد دارد. استرلیزاسیون و پاستوریزاسیون اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  از لحاظ هزینه و مصرف انرژی به صرفه و سازگار با محیط زیست است.

• امولوسیون و سوسپانسیون

فرمول واکسن­ها می­تواند از ترکیب آب-چربی تشکیل شود. از آنجایی که فرمول­های آب و لیپیدی امتزاج ناپذیر هستند، بایستی امولوسیونی تا حد زیادی ریز، از طریق غلبه بر کشش سطحی قطره­ها یا استفاده از سورفاکتانت تهیه شود. امولسیون سازی با اولتراسونیک (تابش فراصوت)  روشی مطمئن برای فرموله کردن نانو و مینی و دبل امولسیون­ها است. برای مثال لیپوپپتیدهای غیر محلول در آب را می­توان از طریق اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  با آنتی­ژن با نسبت 1 به 1 (آب در آب) در یک محلول آبی ترکیب کرد.

علاوه بر این، سونیکاسیون برای کاهش تجمع سلولی و توزیع متوازن سلول پاشیده (single-dispersed) در سوسپانسیون به کار می­رود.

• ادجوانت­ها و نگه دارنده­ها

واکسن­ها معمولاً حاوی یک ادجوانت­ یا بیشتر هستند که برای بهبود پاسخ ایمنی اضافه می­شوند. با اولتراسونیک  (تابش فراصوت) میکروفایبرهای ادجوانت­ها از یک دیگر باز می­شوند و به صورت همگن توزیع می­شوند تا اتصال پروتئین روی سطح بهبود یابد. سیستم­های ادجوانت­ امولسیونی به طور گسترده در تولید و فرموله کردن واکسن استفاده می­شوند. این نوع سیستم­های ادجوانت­ بر پایه امولسیون می­توانند با انواع مختلف امولسیون فرموله شوند، مانند روغن در آب، آب در روغن، آب در روغن در آب یا امولسیون­های پایدارشده با پروتئین.

علاوه بر این، نگه­دارنده­ها جهت جلوگیری از آلوده شدن واکسن با باکتری یا قارچ اضافه می­شوند. نگه­دارنده­ها در مراحل مختلفی از تولید واکسن مورد استفاده قرار می­گیرند.

استفاده از هموژنیزر اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  دستیابی به ترکیب و پراکنشی همگن­ و یک دست­تر را ممکن می­سازد و لذا ابزاری قابل اتکا برای تولید بهینه واکسن است.

• فرمولاسیون و لیپوزومال

کپسوله کردن واکسن­های کپسول شده با لیپوزوم را می­توان به صورت خوراکی، داخل بینی، عضلانی، زیرپوستی تجویز کرد و روش و ادجوانتی کارامدی برای انتقال واکسن است که تحویل هدف را بهبود می­بخشد و احتمال سمی شدن آنتی­ژن درون آن را کاهش می­دهد. سونیکاسیون روشی مطمئن برای کپسوله کردن ترکیبات فعال در فرمول­های لیپوزومی است.

برای مثال، جهت فرموله کردن یک واکسن دامپزشکی برای بیماری نیوکسل[5]، ژائو[6] و همکاران به وسیله فراصوت یک وسیکل یونیلاملار کوچک فسفاتیدیلکلین/کلسترول (SUV) تهیه کردند. واکسنی که با اولتراسونیک(تابش فراصوت)  کپسوله شده بود پاسخ ایمنی بهتر وIgG و IgM و تیتراسیون پادتن بالاتر و همچنین افزایشی در میزان T-cell و B-cell نشان داد.

• گاززدایی

در فرآیند تولید واکسن و دارو، واکسن­ها و مایعات مثل سوسپانسیون­ها، محلول­ها، امولسیون­ها و فرمول­های نهایی باید پیش از بسته­بندی گاززدایی شوند. در مرحله گاززدایی/هوازدایی، حباب­های گازی (مانند اکسیژن، کربن دی­اکسید) که در مایع گیر افتاده­اند، خارج می­شوند. امواج فراصوت انسجام حباب­های گازی گیرافتاده در مایع را افزایش می­دهند. حباب­های منسجم خاصیت شناوری بیشتری دارند و به سمت سطح مایع بالا می­آیند. از بین بردن حباب­های گازی با استفاده از کمی مکش در مجرای تابش فراصوت بهبود می­یابد. گاززدایی به کمک اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  روشی آسان و سریع برای هوازدایی سوسپانسیون­هایی آبی است.

• رشد سلول

تحریک با اولتراسونیک  (تابش فراصوت)  هنگام تلقیح (فرآیند آشنایی میکروارگانیسم با محیط کشت) می­تواند رشد کشت سلول را افزایش دهد. شدت تابش التراسونیک، دما و مدت ماندگاری در زیست رآکتور اولتراسونیک  را می­توان با دقت بالا با توجه به نوع سلول و نیاز آن تنظیم کرد. 

برای مثال، تابش التراسونیک ملایم برای افزایش جذب گلوکوز در سلول به کار می­رود که در ادامه باعث افزایش رشد کشت سلول و سوسپانسیون می­شود. فراصوت نفوذپذیری سلول را افزایش می­دهد که در عوض تبادل بین مواد مغذی و دفعی را بهبود می­بخشد که باعث تولید بهتر واکسن خواهد شد. در نتیجه، مدت زمان تولید واکسن کوتاه می­شود و یا این که بازدهی پروتئین­های واکسن افزایش داده می­شود.

[1] Alhydrogel

[2] E coli

[3] colibacillosis

[4] Melamed

[5] Newcastle

[6] Zhao