برش DNA به کمک التراسونیک (فراصوت)

در طول برش DNA و RNA، مولکول های DNA به قطعات کوچکتر شکسته می شوند. تکه تکه شدن DNA/RNA یکی از مراحل آماده سازی مهم نمونه است که برای ایجاد کتابخانه هایی برای توالی یابی نسل بعدی (NGS) لازم است. برش DNA التراسونیک (فراصوت) از نیروهای حفره صوتی برای شکستن DNA یا  RNA  قطعات  100 – 5kb bp استفاده می کند. برش التراسونیک (فراصوت) امکان قطعه بندی دقیق DNA و انطباق با طول DNA مورد نظر را فراهم می کند.

برش DNA با استفاده از التراسونیک

التراسونیک فاپن راه حل های مختلف، مبتنی بر اولتراسوند (فراصوت) را برای برش DNA، RNA و کروماتین ارائه می دهد. برای سونیکاسیون مستقیم با استفاده از میکرو تیپ، بین یک دستگاه التراسونیک (فراصوت) از نوع پروب (upt 150)  با نوک 3 میلی متری را  انتخاب کنید، یا از  کاپ هورن التراسونیک (فراصوت) برای آماده سازی غیرمستقیم DNA نمونه های مختلف به طور همزمان استفاده کنید.

 تکرارپذیری، عملکرد آسان و کنترل دقیق امکان ایجاد یک کتابخانه قابل اعتماد برای توالی یابی نسل بعدی را فراهم می کند. بر خلاف قطعه قطعه شدن DNA آنزیمی، برش التراسونیک (فراصوت) نیروهای برشی مکانیکی خالص را بدون افزودن مواد شیمیایی اعمال می کند. با تنظیم دقیق پارامترهای فرآیند، برش التراسونیک (فراصوت) قطعات DNA با وزن مولکولی بالا (پلاسمید و DNA ژنومی) تولید می کند. اسیدهای نوکلئیک خالص شده را می توان قبل یا بعد از مرحله قطعه سازی تقویت کرد. پارامترهای فراصوت (قدرت، چرخه پالس، زمان و دما) را می توان با خیال راحت از طریق تنظیمات نرم افزار تغییر داد و کنترل نمود.

مزایای استفاده از پروب التراسونیک (فراصوت) فاپن:

• چرخه های فراصوت و زمان را می توان دقیقاً با اندازه DNA مورد نظر سازگار ساخت.
• کنترل دقیق
• کاربرد برای قطعات DNA با وزن مولکولی بالا
• کنترل دما
• نتایج قابل تکرار
• سریع
• نوک پروب قابل اتوکلاو
• مولد فراصوت (التراسونیک) پروبی و فنجانی

مطالعات بیان ژن  EGFP

برای مطالعات بیان، سویه نوترکیب L. tarentolae p10::F9Begfp1.4dBsat#12 (Jena Bioscience، آلمان) با ژن EGFP (پروتئین فلورسنت سبز ارتقا یافته)، ssu کروموزومی یکپارچه، در محیط های مختلف کشت شد و علاوه بر این با 100 میلی گرم در لیتر نورسئوتریسین (Jena Bioscience، آلمان) تکمیل شده است. در حین کشت، نمونه های 1 میلی لیتری گرفته شد، سانتریفیوژ شد (2000 × گرم، 20 درجه سانتیگراد، 10 دقیقه) و با محلول 0.9٪ NaCl شسته شد، مجدداً در بافر (20 میلی‌مولار HEPES، 5 میلی‌مولار EDTA، 2 میلی‌مولار DTT) معلق شد و با فراصوت با پردازشگر التراسونیک (فراصوت) پروبی متلاشی شد. بقایای سلولی با سانتریفیوژ (6000 × گرم، 4 درجه سانتیگراد، 5 دقیقه) برداشته شد و با الکتروفورز ژل دودسیل سولفات سدیم - پلی آکریل آمید (SDS-PAGE) تحت شرایط احیا مطابق با روش Laemmli (1970) با ژل های پلی آکرلامید 12.5 درصد آنالیز شد. . بیان EGFP در کشت معلق مورد بررسی قرار گرفت (فریتچه و همکاران 2007) .

بررسی ایمنی کروماتین

سنجش ایمنی کروماتین با استفاده از Chip-ITTM Express (Active Motif، Carlsbad، CA، USA) طبق دستورالعمل سازنده با برخی تغییرات انجام شد. به طور خلاصه، پودوسیت‌های تمایز یافته انسانی با فرمالدئید 1 درصد به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق به هم متصل شدند. سلول ها با PBS سرد شسته شدند و واکنش تثبیت با افزودن 0.125 مولار گلیسین به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق متوقف شد. سلول ها مجدداً با PBS سرد یخ شسته و از ظرف تراشیده شدند. سلول ها با سانتریفیوژ پلت شده و در بافر لیز معلق شدند. پس از سانتریفیوژ، هسته های گلوله شده مجدداً در بافر برشی معلق شدند، به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه شدند و کروماتین توسط التراسونیک پروبی با قدرت 25% 5 پالس هر کدام 20 ثانیه روی یخ به قطعات تقریباً 200-600bp تقسیم شد. سپس کروماتین بریده شده سانتریفیوژ شد و مایع رویی جمع آوری شد. برای رسوب ایمنی، 60 میکرولیتر کروماتین با 1 میکروگرم Sp1 (سانتا کروز بیوتکنولوژی، سانتا کروز، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)، NF-κB p65 (Abcam، کمبریج، انگلستان) یا NF-kB p50 (Abcam) آنتی بادی یا با آنتی بادی انکوبه شد. IgG (آزمایشگاه های زیمد، سانفرانسیسکو جنوبی، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا)، به عنوان کنترل منفی، در طول شب در دمای 4 درجه سانتی گراد با چرخش ملایم. کمپلکس‌های ایمنی متصل به دانه‌های مغناطیسی با استفاده از یک پایه مغناطیسی جمع‌آوری شدند، به طور گسترده شسته شدند و پیوندهای متقابل پروتئین/DNA معکوس شدند و DNA برای تجزیه و تحلیل PCR بلادرنگ شسته شد. (Ristola et al. 2009)

آماده سازی DNA EHEC برای تجزیه و تحلیل آرایه تراشه

مرتب سازی سلول های لیز شده و DNAهای استخراج شده

گلوله های باکتریایی معلق در PBS تا غلظت نهایی مورد نظر با التراسونیک پروبی مجهز به یک نوک (قطر 1 میلی متر) تحت تابش قرار گرفتند. فرکانس کاری 30 کیلوهرتز و توان خروجی موثر 100 وات بود. در طول عملیات، نمونه ها در یک حمام آب یخ خنک، مخلوط و سانتریفیوژ شدند. نمونه ها برای مطالعات فلوسیتومتری مورد استفاده قرار گرفتند، در حالی که برای جابجایی بعدی، نمونه ها تحت عملیات حرارتی (95 درجه سانتی گراد، 5 دقیقه) قرار گرفتند. سلول های لیز شده خام با مخلوطی از فنل: کلروفرم: ایزوآمیل الکل (25:24:1) پردازش شدند. حجم مساوی از این مخلوط به نمونه لیزشده اضافه شد، محلول به مدت 15 ثانیه به شدت گرداب شد و در 15000 x g به مدت 2 دقیقه در دمای اتاق (RT) در حدود 22 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد. فاز آبی بالای حاوی DNA ژنومی به دقت جدا شده و در یک لوله اپندورف استریل جدید جمع آوری شد.

پس از آن، نمونه‌ها برای قطعه قطعه کردن DNA، فراصوت شدند. مرحله فراصوت در همان شرایطی که در بالا توضیح داده شد محقق شد. برای ارزیابی اثرات تکه تکه شدن بر روی DNA ژنومی، نمونه ها با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

نمونه هایی که قبلاً به مدت 2.5 دقیقه سونیک شده بودند، پس از عملیات حرارتی و سانتریفیوژ در معرض مرحله استخراج قرار گرفتند. DNA آزاد شده دو بار با مخلوط فنل: کلروفرم: ایزوآمیل الکل استخراج شد و سپس به مدت 0 تا 15 دقیقه در معرض سونیکاسیون دوم قرار گرفت. الکتروفورز ژل آگارز برای تعیین توزیع اندازه DNA در معرض تکه تکه شدن التراسونیک (فراصوت) پس از استخراج استفاده شد (شکل در سمت راست بالا). DNA بسیار تکه تکه شده از حضور یک اسمیر DNA به جای نوارهای با وزن مولکولی بالا که از نمونه های سونیک شده برای 2.5 دقیقه یا بیشتر حذف شدند، مشهود بود. سونیکاسیون طولانی‌تر به تدریج طول قطعات را به حدود 150 تا 600 جفت باز کاهش داد، و سونیکاسیون به مدت 15 دقیقه بیشتر این قطعات را تخریب کرد، همانطور که بیشتر در قسمت بالایی اسمیر دیده می‌شود. بنابراین، میانگین اندازه قطعه DNA به تدریج با زمان فراصوت کاهش یافت و درمان 5 دقیقه ای اجازه داد تا اندازه قطعات DNA مناسب ترین برای سنجش آرایه تراشه به دست آید. در نهایت، روش آماده سازی آنالیت DNA شامل 2 دقیقه اول درمان التراسونیک (فراصوت)، استخراج DNA (2×)، و 5 دقیقه بعدی فراصوت ایجاد شد. (Basselet و همکاران 2008)

رسوب ایمنی کروماتین (ChIP)

سلول های HEK293 همانطور که در بالا توضیح داده شد کشت داده شدند و با 2 میلی مولار دی سوکسینیمیدیل گلوتارات به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق ثابت شدند. سپس سلول ها دو بار با PBS شسته شدند. کروماتین به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق با استفاده از فرمالدئید 1% (v/v) متصل شد و دو بار با PBS سرد یخ شسته شد. واکنش اتصال متقابل با انکوباسیون با گلیسین در غلظت نهایی 0.125 مولار به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق متوقف شد. پس از انکوباسیون با تریپسین، سلول ها از ظرف کشت سلولی تراشیده شدند و دو بار با PBS شسته شدند. گلوله سلولی در بافر لیز (5 میلی‌مولار لوله‌ها، pH 8.0، 85 میلی‌مولار KCl، و 0.5 درصد (v/v) Nonidet P-40 مجدداً معلق شد، به مدت 10 دقیقه روی یخ انکوبه شد و با هموژنایزر همگن شد. متعاقبا، هسته ها با سانتریفیوژ (3500 x g، 5 دقیقه، 4 درجه سانتی گراد) گلوله شدند و در بافر هسته (50 میلی مولار Tris-HCl، pH 8.1، 10 میلی مولار EDTA، و 1٪ (w/v) SDS) مجدداً معلق شدند. هسته‌ها با سونیکاسیون با سه پالس 20 ثانیه در دستگاه سونیکاتور پروبی در یک چرخه 0.5 و دامنه 30 درصد مختل شدند و قطعات DNA ژنومی با اندازه توده‌ای 200 تا 1000 جفت باز به دست آمد. برای تراشه، 50 گرم DNA 4 برابر در بافر رسوب ایمنی رقیق شد (16.7 میلی مولار Tris-HCl، pH 8.1، 167 میلی مولار NaCl، 1.2 میلی مولار EDTA، 1.1٪ (v/v) Triton X-100، و 0.01٪ (وزنی) v) SDS). (Weiske et al. 2006)

آنالیز اصلاحی هیستون با روش ایمونوپسیت کروماتین (ChIP)

به طور خلاصه، 6 میلیون سلول، دو بار با PBS شسته شدند و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق در حضور فرمالدئید 0.5٪ روی صفحه کشت به صورت متقابل پیوند داده شدند. واکنش اتصال متقابل با افزودن 0.125 مولار گلیسین متوقف شد. تمام مراحل بعدی در دمای 48 درجه سانتی گراد انجام شد. تمام بافرها از قبل سرد شده و حاوی مهارکننده های پروتئاز (کامپلیت مینی، روشه) بودند. سلول ها دو بار با PBS شسته و سپس خراش داده شدند. گلوله های جمع آوری شده در 1 میلی لیتر بافر لیز (1٪ SDS، 5 میلی مولار EDTA، 50 میلی مولار Tris pH 8) حل شدند و در حمام اتانول سرد به مدت 10 سیکل با دامنه 100٪ با استفاده از دستگاه سونیکاتور مورد تابش فراصوت قرار گرفتند. قطعه قطعه شدن کروماتین در ژل آگارز 1 درصد مشاهده شد. قطعات به دست آمده در محدوده 200-500 pb بودند. کروماتین محلول با سانتریفیوژ کردن نمونه های فراصوت شده در 14000 گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 48 درجه سانتی گراد به دست آمد. کسر محلول 1/10 در بافر رقت (1٪ Triton X-100، 2 میلی مولار EDTA، 20 میلی مولار Tris pH 8، 150 میلی مولار NaCl) رقیق شد و سپس در 80 درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری شد. (رودریگز و همکاران 2008)

همچنین پیوندهای زیر را ببینید:

سنتز پپتید با استفاده از التراسونیک (فراصوت)

اثرات فیزیکی و شیمیایی فراصوت (امواج التراسونیک) و حفره سازی